STERILISASI,
PEMBUATAN MEDIUM, PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA, DAN PEWARNAAN GRAM
Disusun
oleh :
Kelompok
VIIB
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
JURUSAN
S-1 PETERNAKAN
FAKULTAS
PETERNAKAN DAN PERTANIAN
UNIVERSITAS
DIPONEGORO
SEMARANG
LEMBAR
PENGESAHAN
Judul : LAPORAN
RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Kelompok : IIIF (TIGA)F
Jurusan : S-1 PETERNAKAN
Fakultas : PETERNAKAN DAN
PERTANIAN
Tanggal Pengesahan : .... Juni 2014
Menyetujui,
|
Koordinator Asisten
Praktikum Mikrobiologi
Jenny Febrianti
NIM. 23010111120031
|
Asisten Pembbimbing
Nama
Nim
|
|
|
|
|
|
|
Mengetahui,
Koordinator Umum Mikrobiologi
Dr. Dra. Turrini Yudiarti, M.Sc.
NIP. 19591202 198703 2 002
RINGKASAN
Kelompok IIIF. 2014. Laporan resmi Praktikum
Mikrobiologi (Asisten : SANTI SULISTIANI).
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 22
Mei 2014 pukul 11.00 – 12.00 WIB dan materi Metode Hitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram pada hari Jum’at tanggal. 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB di
Laboratorium Fisiologi dan Biokimia, Fakultas Peternakan dan Pertsnian,
Universitas Diponegoro, Semarang.
Materi dalam
Praktikum Mikrobiologi meliputi bahan yaitu agar-agar, ekstrak kentang, dextrose, aquades, asam tartarat,
kertas pembungkus, kapas, alkohol, aluminium foil, sampel bakteri yang akan
dihitung, medium, larutan gram (A (violet krista), B (lugol), C (etanol) dan D (safranin)) untuk pewarnaan gram, dan
biakan bakteri serta alat yang digunakan adalah timbangan untuk
menimbang medium kentang, erlenmeyer untuk mereaksikan
bahan, waterbath untuk memasak/merebus kentang, beker glassuntuk
memasak kentang, gelas ukur untuk mengukur kebutuhan air yang diperlukan, pisau
untuk memotong bahan, kain saring untuk membuat filtrat, pH meter untuk
mengukur kadar pH, oven untuk sterilisasi kering pada alat, autoklaf untuk
sterilisasi basah, cawan petri sebagai tempat pembuatan medium, pipet hisap untuk
mengambil sampel, tabung reaksi untuk mereaksikan bahan, pipet untuk memipet
sampel dan pereaksi, bunsen untuk mensterilkan dan memanaslan alat serta bahan,
kaca objek untuk menempatkan objek, loop untuk memperbesar gambar dan
mikroskop untuk memperbesar gambar yang sangat kecil.
Tujuan dari
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium adalah memahami dan mampu melaksanakan
percobaan sterilisasi alat berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan
metode terilisasi kering, serta mampu membuat medium Potato Dextrose
Agar (PDA) dengan menggunakan kentang yang
diekstraksi. Pada Praktikum Mikrobiologi dengan materi Metode Hitung Cawan dan
Pewarnaan Bakteri, mahasiswa memahami dan mampu melaksanakan perhitungan
bakteri menggunakan loop serta mampu melakukan pewarnaan gram menggunakan gram
A (violet krista), gram B (lugol), gram C (etanol), dan gram D (safranin) pada
bakteri Lactobacillus acidophilus.
Kata Kunci : Sterilisasi, Pembuatan Medium, Perhitungan Jumlah
Mikroba, Pewarnaan Gram
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR................................................................................ iv
DAFTAR TABEL....................................................................................... v
DAFTAR ILUSTRASI...............................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................
vii
BAB I PENDAHULUAN..........................................................................
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................
2.1. Sterilisasi............................................................................
2.2. Pembuatan
Medium...........................................................
2.3. Metode Hitungan Cawan..................................................
2.4. Morfologi
Bakteri..............................................................
2.5. Pewarnaan
Gram...............................................................
BAB III MATERI DAN METODE...........................................................
3.1. Materi...............................................................................
3.1.
Metode.............................................................................
BAB IV HASIL DAN
PEMBAHASAN.................................................
4.1.
Sterilisasi..........................................................................
4.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)..........
4.3. Penghitungan Jumlah
Mikroba.........................................
4.4. Pewarnaan
Gram..............................................................
BAB V SIMPULAN DAN
SARAN........................................................
5.1.
Simpulan...........................................................................
5.2.
Saran.................................................................................
DAFTAR
PUSTAKA................................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................
DAFTAR
TABEL
Halaman
Tabel 1. Anatomi Saluran Pencernaan Ruminansia........................... 1
DAFTAR
ILUSTRASI
Ilustrasi Halaman
1. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Positif Pebesaran 1000 kali
2. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Negatif Perbesaran 1000 kali
DAFTAR
LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gambar
dan Fungsi Alat
2. Perhitungan
SPC (Standart Plate Count)
3. Fotocopy
Laporan Hasil Praktikum
BAB I
PENDAHULUAN
Mikrobiologi
merupakan suatu telaah studi mengenai mikroorganisme. Mikroorganisme merupakan
organisme hidup yang berukuran kecil yang hanya dapat dilihat secara
mikroskopis. Mikroorganisme yang ada di alam terdiri dari berbagai macam jenis
dan jumlahnya tidak terbatas. Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak
dimana saja dengan syarat cukup nutrien dan berkembang pada mรฉdium yang tepat.
Medium dapat berupa mรฉdium cair, mรฉdium padat dan mรฉdium setengah padat.
Mikroorganisme baik yang membentuk koloni atau tidak, saat berkembang pada
suatu medium dapat diketahui jumlahnya dengan beberapa metode salah satunya
adalah metode hitungan cawan. Mikroorganisme ada yang memiliki sifat
menguntungkan dan ada juga yang bersifat merugikan, untuk mengetahuinya dapat
dilakukan serangkaian pengujian melalui pewarnaan mikroorganisme.
Tujuan dari praktikum
mikrobiologi ini yaitu untuk mengetahui cara pembuatan medium dan larutan
pengencer, cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan
cawan dan cara pewarnaan gram positif maupun negatif. Manfaat dari praktikum
mikrobiologi ini adalah mengetahui cara pembuatan medium dan larutan pengencer,
cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan cawan serta
mengetahui cara pewarnaan gram positif maupun negatif.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Sterilisasi
Sterilisasi
medium memerlukan lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi
alat-alat, yakni 15 menit, tetapi menggunakan suhu dan tekanan yang sama
(Hendaryono dan Ari, 1994). Bahan yang dapat disterilkan dengan autoklaf adalah
media biakan, larutan, kapas, dan peralatan laboratorium (Gunawan, 2000).
Sterilisasi adalah suatu proses yang menghancurkan semua bentuk kehidupan.
Setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang mematikan semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2007).
Suatu benda yang steril dipandang dari sudut mikrobiologi, artinya bebas dari
mikroorganisme hidup. Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan uap panas,
larutan kimia, pemanasan kering atau metode gas (Adji et al., 2007).
2.1.1
Sterilisasi
Kering
Sterilisasi dengan
panas kering atau udara panas dianjurkan apabila penggunaan uap bertekanan yang
akan disterilkan. Hal ini berlaku bagi peralatan laboratorium seperti cawan
petri, pipet hisap, juga peralatan lainnya. Benda-benda ini kemudian disterilkan
dalam oven listrik atau gas dengan suhu 1600C selama 2 jam (Pelczar et
al., 1988). Sterilisasi alat dan media dilakukan dengan menggunakan oven yang
digunakan untuk mensterilkan cawan petri dan pipet volume. Penggunaan alat ini
dengan cara memasukkan alat-alat tersebut dalam oven dan dipanaskan dengan suhu
1600-1700C selama 1-2 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.1.2
Sterilisasi
Basah
Sterilisasi basah biasanya menggunakan alat autoklaf
yaitu serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Autoklaf biasanya
digunakan untuk mensterilkan medium baik yang berasal dari agar maupun dari air
susu. Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan.
Alat-alat yang berupa glass ware
maupun dissecting kit sebelum
digunakan harus disterilkan dahulu. Demikian juga medium yang sudah dimasukkan
ke dalam botol medium harus disterilkan juga (Hendaryono dan Ari, 1994).
Sterilisasi alat dan media yang dilakukan dengan menggunakan autoclaf untuk mensterilkan tabung
reaksi bertutup dan erlenmayer. Penggunaan alat ini dengan memasukkan alat-alat
tersebut kedalam autoklaf yang ditutup dengan rapat dan menyalakan autoklaf
dengan temperatur 1200C dan tekanan antara 15-7,5 psi (pound per squareinci) atau 1 atm selama
1 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.2
Pembuatan
Medium
Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin laboratorium ialah kaldu
cair dan kaldu agar (Dwidjoseputro, 2005). Pembuatan medium dapat dilakukan
dengan cara menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti,
kemudian mencampurkannya, melarutkannya di dalam air, mengatur keasaman,
memasukkan ke dalam tabung, dan mensterilkan menggunakan autoklaf pada suhu dan
waktu yang telah ditetapkan (Fardiaz, 1989).
2.2.1
Medium Nutrien Agar (NA)
Media padat NA
dibuat dengan cara melarutkan NA sebanyak 2 gram dalam 100 mL aquades. Larutan
dipanaskan sambil diaduk agar bubuk NA dapat larut sempurna. Setelah larut
media ini dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan cawan petri. Untuk tabung
reaksi mulut tabung ditutup dengan kapas berlemak yang telah dibungkus dengan
kasa steril. Media tersebut kemudian disterilkan dengan autoklaf pada 1210C
selama 15 menit. Media padat disimpan dalam inkubator sampai memadat
(Buditianingsih et al., 2010). Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) sebanyak 200
mL 0,6 g Beef extract + 1 g Pepton +
3 g Agar dimasukkan dalam erlenmayer dan cukupkan volumenya dengan aquades 200
mL, kemudian dimasak dalam air mendidih selama 15 menit, lalu disterilkan dlam
autoklaf (Pratiwi, 2005).
2.2.2
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Jumlah fungi dalam makanan dapat dihitung dengan
metode hitungan cawan menggunakan medium Potato
Dextrose Agar (PDA). Biasanya pembuatan biakan murni menggunakan media PDA
yang tersusun oleh kentang, gula dalam bentuk dextrose, agar-agar dan aquades (Warisno dan Dahana, 2009). PDA
adalah suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup,
yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa, sehingga baik untuk
pertumbuhan fungi tetati kurang baik untuk pertumbuhan bakteri, akan tetapi karena
beberapa bakteri juga memfermentasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai
sumber energi, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh pada Potato Dextrose Agar (PDA) (Aprintasari
et al., 2012).
2.2.3
Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Medium padat atau solid medium adalah
medium yang berbentuk padat dan
mengandung 1,5 – 1,8% agar misalnya terdapat pada Acidified Potato Dextrose Agar
(Fardiaz, 1993). Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme
terdapat dalam bentuk padat setengah padat dan cair. Medium padat contoh APDA
mengandung karbohidrat kompleks dan agar-agar dari alga merah serta mengandung
APDA tersebut mengandung molekul organik kompleks untuk pertumbuhan bakteri
(Schlegal, 1994).
2.3
Metode
Hitungan Cawan
2.3.1
Pengenceran
dan Metode Tuang (Pour Plate)
Pengenceran
bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari suatu bahan agar
setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya dapat dihitung
dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi paling baik yaitu
antara 30-300 koloni. Perbandingan dalam melakukan pengenceran biasanya dalam
bentuk desimal, misalnya 1:10 , 1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk melakukan pengenceran biasanya buffer fosfat, larutan garam
fisiologis 0,85%, larutan ringer juga aquades (Dwidjoseputro, 1993).
Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang
didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan
mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri
steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (Acidified Potato Dextrose
Agar) steril hangat dengan suhu antara 40 – 50°C, kemudian ditutup rapat dan
diletakkan dalam inkubator bersuhu 37°C selama 1 – 2 hari dengan posisi dibalik
(Megamii, 2009).
Metode penuangan dengan mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam
suatu medium dari kaldu atau gelatin encer. Setelah mengental, maka akan nampak
koloni-koloni yang dianggap murni. Metode ini ditemukan Robert Koch. Disamping
itu ada seorang lagi yang berjasa yaitu Petri, yang menemukan cawan petri
dibantu dengan Hasse yang menemukan agar-agar untuk menggatikan gelatin. Agar
lebih baik dari pada gelatin karena agar tidak lekas mencair dan memiliki titik
cair 95oC (Dwidjoseputro, 1989). Media
yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses
penuangan, media panas juga masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada
cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni
akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di
dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator selama 48
jam (Megamii, 2009).
2.3.2
Perhitungan
Mikroba Berdasarkan Standart Plate Count
(SPC)
Salah satu cara
penghitungan bakteri adalah dengan menggunakan metode hitung cawan atau Standard Plate Count (SPC). Prinsip
kerjanya adalah jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang
dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300
koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya,
maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni
dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991).
2.4
Morfologi
Bakteri
Bentuk umum
bakteri terdiri dari satu sel (uniseluler), bentuk lainnya berupa koloni yaitu
gabungan dua sel atau lebih di dalam satu ruang. Variasi bentuk bakteri yaitu
bulat (kokus), batang atau bulat memanjang (basil) dan lengkung (Ilyas, 2001
dalam Khairani, 2010). Bakteri dapat hidup dengan memanfaatkan makanan yang ada
di lingkungannya. Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk kelas Schizomycetes, berkembang biak secara
aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang
bersifat fotosintetik (Sumarsih, 2003).
2.4.1
Bakteri
Gram Positif
Dinding
sel bakteri gram positif terdiri atas 40 lapis rangka dasar murein, yang
meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun
dinding sel gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan
asam teikoat yang sangat spesifik (Sumarsih, 2003). Berdasarkan komposisi
dinding sel bakteri, dinding sel bakteri gram positif mengandung 90%
peptidoglikan selebihnya adalah asam teikoat. Sel bakteri gram positif terlihat
berwarna ungu, disebabkan karena bakteri tersebut dapat membentuk ikatan
komplek dengan pewarna gram (Nursanty et al., 2013). Bakteri kelompok gram positif bersifat
menguntungkan karena bisa menjadi probiotik bagi ternak ayam (Manin, 2010). Lactobacillus caseii dan Lactobacillus bulgaricus merupakan probiotik yangtergolong kepada bakteri baik (Pangkalan
Ide, 2008).
2.4.2
Bakteri
Gram Negatif
Dinding sel
bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan
hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung
diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut
terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain.
Senyawa-senyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak
terdapat dalam dinding sel ini (Sumarsih, 2003). Dinding sel bakteri gram
negatif terdiri dari 5- 20% peptidoglikan, selebihnya adalah polisakarida. Pada
sel bakteri gram negatif pemberian larutan alkohol 95% dapat meningkatkan
porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar sehingga
komplek ungu kristal-iodium akan terlepas dan sel menjadi tidak berwarna. Selanjutnya
sel akan berwarna merah disebabkan karena terwarnai oleh warna safranin
(Nursanty et al., 2013). Salah satu
contoh bakteri gram negatif yaitu Escherichia
coli (Ferdiaz,1989).
2.5
Pewarnaan
Gram
Pewarnaan gram
berguna untuk membedakan gram positif dan gram negatif. Pembeda hasil pewarnaan
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur kedua kelompok bakteri tersebut
sehingga menyebakan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna (Lay dalam
Chaerani, 2010). Karakterisasi bakteri dapat dilakukan menggunakan zat warna
kristal violet dan safranin (Khairani, 2010). Bahan untuk uji
pewarnaan Gram (crystal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol 95%,
dan aquades) (Campbell et
al.,2004).
BAB III
MATERI DAN METODE
Praktikum
Mikrobiologi yang dilaksanakan pada hari Kamis
tanggal 22 Mei 2014 pukul 11.00-14.00 WIB dengan materi Sterilisasi, Medium dan Larutan Pengenceran
serta pada hari Jum’at tanggal 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB dengan materi Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram yang di laksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro,
Semarang.
3.1
Materi
Alat yang
digunakan dalam praktikum mikrobiologi ini adalah timbangan yang berfungsi
untuk menimbang sampel, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat menyimpan
larutan, kain saring yang berfungsi untuk menyaring kentang untuk diambil
filtratnya, kompor listrik yang berfungsi untuk mendidihkan air, oven dan
autoklaf yang berfungsi untuk memanaskan alat-alat praktikum, pengaduk magnetik
yang berfungsi untuk mengaduk medium, cawan petri yang berfungsi sebagai tempat
mikroba ditumbuhkan, pipet hisap yang berfungsi untuk memindahkan larutan dalam
ukuran kecil, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat larutan, kaca objek
sebagai tempat sampel yang akan diamati, bunsen untuk memanaskan objek,
mikroskop yang berfungsi untuk mengamati bakteri dengan perbesaran tertentu,
alat tulis dan buku panduan praaktikum yang berfungsi untuk mencatat hasil
pengamatan. Sedangkan bahan yang digunakan adalah kentang yang telah dipotong
berbentuk dadu, dextrose, agar,
aquades, alkohol, susu UHT, medium, larutan gram A (ungu kristal 90%, etanol
95%, amonium oksalat dan aquades). Larutan gram B (kristal iodium, kalium
iodida dan aquadest), larutan gram C (etanol 95 %), dan larutan gram D (larutan
safranin dan aquadest ), dan biakan bakteri, Escherichia coli dan Lactobacillus
acidophilus.
3.2
Metode
3.2.1
Sterilisasi
3.2.1.1
Sterilisasi
Kering
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan pipet, cawan petri serta
alat gelas lainnya sesuai dengan kebutuhan. Kemudian membersihkan cawan petri
menggunakan kapas dengan membasahi menggunakan alkohol untuk menghilangkan
lemak dan kotoran yang menempel pada cawan petri, kemudian membungkusnya dengan
kertas pembungkus. Membersihkan pipet volum serta menyumbat bagian pangkal
pipet menggunakan kapas, kemudian membungkusnya menggunakan kertas pembungkus.
Memasukan cawan petri, pipe dan erlenmeyer pada oven selama 1 jam dengan suhu
170oC. Setelah selesai, mengeluarkan cawan petri dan pipet dari oven, tunggu
hingga suhu turun sebelum menggunakannya.
3.2.1.2
Sterilisasi Basah
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama memasukkan medium sebelum
mensrterilkannya kedalam erlenmeyer serta larutan pengencer kemudian tutup
rapat menggunakan kapas. Memasukan erlenmeyer dan tabung reaksi ke dalam autoclave, kemudian menutup autoclave hingga rapat, menyalakan autoclave, menunggu hinga manometer dan
termometer menunjukan tanda sterilisasi atau pada suhu 1210C dengan
tekanan 2 atm, mendiamkannya selama 15 menit. Setelah 15 menit menunggu hingga
tekanan autoclave berkisar 0,5 atm,
membuka katup pengaman dan membiarkan hingga autoclave tidak bertekanan, setelah itu membuka autoclave dan medium. Untuk medium
berupa agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku maka
memasukannya kedalam inkubator bersuhu 550C, sebelum digunakan.
3.2.2
Pembuatan
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Menimbang
kentang sebanyak 250 g. Memasukan kentang kedalam beker glass, kemudian
menambahkan 500 ml aquades, lalu menutupnya menggunakan aluminium foil serapat
mungkin. Memanaskannya diatas pemanas hingga mendidih. Mengambil filtrat
kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Setelah filtrat
terkumpul, mengukur volumenya untuk membuat PDA dengan komposisi 100 ml filtrat
kentang, 2 g dextrose, 2 g agar serta
pH 6,8 – 7,2.
3.2.3
Penghitungan
Jumlah Mikroba
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan serta memberi label
larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran dan
pemupukan. Melakukan pengenceran hingga tingkat
pengenceran yang ditentukan. Kemudian melakukan
pencawanan pada tiga tingkat pengenceran terakhir. Selanjutnya menuangkan 10 ml medium agar kedalam
cawan petri kemudian menggoyangkannya membentuk angka delapan hingga sampel
merata. Setelah medium membeku, melakukan inkubasi dengan posisi terbalik pada
suhu ruangan selama 24 – 48 jam. Menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada
cawan dan melaporkan jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.
3.2.4
Pewarnaan
Gram
Mengambil kaca
objek atau preparat lalu memberikan setetes aquades pada kaca. Mengambil
sejumlah mikroba pada ujung loop fiksasi dengan nyala api kecil pada bunse.
Meneteskan violet kristal (gram A) di atas preparat diamkan selama 1 menit.
Membilas dengan aquades lalu membuang sisa air yang tertinggal dan menetesi
dengan larutan lugol (gram B) kemudian didiamkan selama 2 menit. Membilas
dengan aquades kemudian menghilangkan warna dengan gram C sampai warna biru
tidak luntur lagi. Membilas kembali dengan aquades kemudian menetesi dengan
safranin (gram D) diamkan selama 30 detik lalu membilas dengan air dan
mengeringkan dengan menggunakan tisu. Mengamati kaca objek pada mikroskop
dengan perbesaran 100x.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Sterilisasi
4.1.1
Sterilisasi Kering
Berdasarkan
hasil praktikum yang telah dilakukan sterilisasi alat
berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan oven memiliki tujuan untuk
menghilangkan bakteri yang menempel pada alat. Sterilisasi menggunakan
oven merupakan sterilisasi kering berupa panas kering. Hal ini sesuai pendapat
Antonius (2006) bahwa sterilisasi ada berbagai macam salah satunya secara
fisika yaitu dengan panas kering (Hot Air
Oven).Mencuci pipet hisap dan cawan petri menggunakan alkohol dan membasuh
dengan kapas sebelum memasukkan ke dalam oven. Menyumbat alat pipet pada
salah satu ujungnya, supaya tidak terjadi perpindahan udara dan bakteri melalui
rongga pipet. Membungkus alat menggunakan kertas supaya tidak ada kontaminasi
bakteri luar dan kemudian memasukkan ke dalam oven. Sterilisasi menggunakan
oven ini, menerapkan suhu 1600C
selama 2 jam. Tujuannya, untuk mematikan bakteri karena rata-rata bakteri mati
pada suhu 100 oC, maka bakteri di dalam bungkus kertas dapat
mati dan alat-alat menjadi steril. Hal ini diperkuat dengan
pendapat Darwis (2006) bahwa sterilisasi adalah suatu proses untuk
menghilangkan atau menginaktivasi mikroorganisme hidup.
4.1.2
Sterilisasi Basah
Sterilisasi
panas basah (autoklaf), yaitu dengan menggunakan medium basah dan dipanaskan
dengan suhu 1210C.
Sterilisasi ini cukup singkat waktunya, jika membandingkan dengan sterilisasi
kering. Hal ini sesuaidengan pendapat Antonius (2006) bahwa
secara teori prosedur sterilisasi memakai autoklaf dikatakan lebih efektif
karena suhunya lebih rendah, dan waktu yang diperlukan lebih singkat selain itu daya bunuh pada mikroorganisme juga lebih tinggi. Hal
ini diperkuat oleh pendapat Hadioetomo (2003) bahwa sterilisasi
menggunakan autoklaf dilaksanakan dengan suhu 1210C selama 15 menit. Cara
kerja autoklaf, yaitu menggunakan tekanan tinggi, sehingga bakteri mati dan
alat-alat menjadi steril.
4.2 Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
Pada pembuatan Medium
PDA, menggunakan ekstrak kentang 100 ml dan menambahkan 6 gram agar dan 2 gram dextrose.
Hal ini sesuai dengan pendapat Yuliar (2008), yang menyatakan bahwa pembuatan
media PDA dibuat dengan melarutkan agar ke dalam akuades (9 x filtrat) dan disterilisasi
menggunakan auotoklaf kemudian dituang ke dalam cawan petri. Langkah selajutnya
menginkubasi selama satu hari, untuk membiakkan bakteri. Berdasarkan hasil
praktikum yang telah dilakukan, praktikum pembuatan medium untuk menumbuhkan
mikroba telah berhasil menumbuhkan bakteri, hal ini ditandai dengan timbulnya
beberapa koloni pada cawan petri. Tumbuhnya mikroba dalam medium menandakan
bahwa medium PDA yang dibuat sesuai dengan prosedur dan memiliki kandungan
nutrien yang cukup untuk tumbuhnya mikroba. Namun, koloni belum terbentuk
secara sempurna. Hal ini disebabkan waktu inkubasi kurang lama atau suhu yang
dibutuhkan mikroba untuk membentuk koloni kurag optimum atau dapat dikatakan
suhu berpengaruh pada pembentukan koloni. Hal ini sesuai pendapat llyas dalam
Khairani (2010) bahwa bentuk dan jumlah pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh
lingkungan yang tidak mengutungkan, faktor makanan dan suhu.
4.3 Penghitungan Jumlah Mikroba
Berdasarkan
praktikum yang telah dilakukan diperoleh hasil sebgai berikut :
Tabel 1. Hasil Perhitungan
Koloni Bakteri
|
Medium
|
Pengenceran
|
SPC
|
||
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
||
|
PDA
|
130
|
50
|
37
|
1,3 x 10-4
|
Sumber : Data Primer Praktikum
Mikrobiologi, 2014
Pada hasil
percobaan yang dilakukan pengenceran sebanyak 3 kali, terlihat pada cawan
pertumbuhan dari koloni tidak terlalu rapat. Sebanyak 130 koloni
bakteri terlihat pada pengenceran 10-3 ,
sedangkan pada pengenceran 10-4 terlihat
50 koloni
bakteri, dan sebanyak 37
koloni bakteri terlihat pada pengenceran 10-5. Hal ini kemudian diperkuat dengan pendapat
Harmita dan Maksum (2008) yang menyatakan bahwa pertumbuhan bakteri yang terlalu rapat,
hasilnya akan sulit dipertanggungjawabkan. Demikian juga untuk pertumbuhan yang
terlalu jarang sehingga diperlukan pemilihan cawan petri yang pertumbuhan
koloni bakterinya paling layak untuk
dihitung, yang biasanya diambil dari cawan petri yang pertumbuhan koloninya
berkisar 30-300 koloni per cawan petri. Dalam hal ini Chang (2003)
menambahkan bahwa dalam melakukan proses pengenceran, penambahan lebih banyak
pelarut ke dalam sejumlah tertentu larutan stok akan mengubah (mengurangi)
konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat pelarut yang terdapat dalam
larutan, dengan kata lain mol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan mol
zat terlarut setelah pengenceran.
4.4. Pewarnaan Gram
4.4.1 Lactobacillus
acidophilus
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Lactobacillus acidophilus
diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Lactobacillus
acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
|
|
|
|
Bentuk : Bacil
Warna : Biru keunguan
Gram : B
(Positif)
|
Bentuk : Bacil
Warna : ungu
Gram : B (Positif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Berdasarkan
hasil pengamatan pada percobaan pewarnaan gram terhadap bakteri Lactobacillus didapatkan warna ungu
dan berbentuk bacillus. Hal ini
sesuai dengan pendapat Dwijoseputro (2004), yang menyatakan bahwa
bakteri berdasarkan morfoginya bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga
golongan yaitu basil, kokus dan spiril. Basil (bacillus) dan bakteri lactobacillus
ini berbentuk batang, bervariasi
panjang dan ramping. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi gram positif dan
negatif, hal sesuai dengan pendapat Agustina et al., (2013) yang
menyatakan bahwa pewarnaan grampositif adalah yang mempunyai zat warna asli
yaitu ungu jika di tetesi, dan gram positif lebih peka terhadap fenol,
penisilin, dan resisten terhadap streptomisinin. Dan gram negatif berwarna
merah karena yang demikian ini dinamai gram variabel.
4.4.2 Escherichia
coli
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Escherichia
coli diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Escherichia
coli
|
Escherichia coli
|
Escherichia coli
|
|
|
|
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A
(negatif)
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A (negatif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Pada percobaan pewarnaan gram pada
bakteri Escherichia coli dengan menggunakan pewarna
gram berupa violet krista, lugol, etanol serta safranin, didapatkan hasilnya adalah warna
merah. Hal ini menunjukkan bahwa sifat dari bakteri ini adalah gram negatif.
Pada saat mengamati menggunakan mikroskop, menunjukkan adanya sifat dari bakteri Esterechia coli yang menyendiri dan
sebagian berkelompok membentuk koloni. Bentuk yang nampak yaitu bulat-bulat
kecil dan merata. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Sousa (2006) yang
menyatakan bahwa Escherichia coli merupakan
bakteri non-spora berbentuk bulat. Hal
yang sama dijelaskan oleh
Melliawati (2009) bahwa secara umum E. coli bentuk bulat cenderung ke batang panjang. Pada bentuk
batang, biasanya berukuran 0,5 x 1 - 3 ยต. terdapat yang sendiri-sendiri, berpasang-pasangan dan
rangkaian pendek, biasanya tidak membentuk spora, merupakan bakteri gram
negatif, merupakan parasit dalam saluran pencernaan makanan manusia dan hewan
berdarah panas, serta koloninya ditemukan dalam feses.
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1
Simpulan
Hasil praktikum
mikrobiologi dapat disimpulkan, bahwa metode sterilisasi terdiri dari dua
jenis, dapat dilakukan dengan sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Bakteri dapat dikembangbiakkan melalui medium agar, PDA serta dapat
diketahui ciri-cirinya melalui pewarnaan gram dan melihat melalui mikroskop. Bakteri
dapat dihitung jumlah koloninya, dengan bantuan loop dan counter. Jenis
bakteri, dapat diidentifikasi menggunakan pewarna gram, sehingga diperoleh
hasil gram positif dan gram negatif. Lactobacillus acidophilus merupakan
bakteri gram positif, sedangkan Escherichia
coli merupakan bakteri gram negatif.
5.2
Saran
Diharapkan
pada praktikan lebih memperhatikan ketersediaan alat serta bahan yang akan
digunakan dalam praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan baik, serta
diharapkan melakukan pengecekan terhadap alat-alat yang akan digunakan sehingga
tidak terjadi kerusakan yang dapat berakibat fatal. Dan tidak lupa meningkatkan
komunikasi antara praktikan dan asisten.
STERILISASI,
PEMBUATAN MEDIUM, PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA, DAN PEWARNAAN GRAM
Disusun
oleh :
Kelompok
VIIB
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
JURUSAN
S-1 PETERNAKAN
FAKULTAS
PETERNAKAN DAN PERTANIAN
UNIVERSITAS
DIPONEGORO
SEMARANG
LEMBAR
PENGESAHAN
Judul : LAPORAN
RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Kelompok : IIIF (TIGA)F
Jurusan : S-1 PETERNAKAN
Fakultas : PETERNAKAN DAN
PERTANIAN
Tanggal Pengesahan : .... Juni 2014
Menyetujui,
|
Koordinator Asisten
Praktikum Mikrobiologi
Jenny Febrianti
NIM. 23010111120031
|
Asisten Pembbimbing
Nama
Nim
|
|
|
|
|
|
|
Mengetahui,
Koordinator Umum Mikrobiologi
Dr. Dra. Turrini Yudiarti, M.Sc.
NIP. 19591202 198703 2 002
RINGKASAN
Kelompok IIIF. 2014. Laporan resmi Praktikum
Mikrobiologi (Asisten : SANTI SULISTIANI).
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 22
Mei 2014 pukul 11.00 – 12.00 WIB dan materi Metode Hitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram pada hari Jum’at tanggal. 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB di
Laboratorium Fisiologi dan Biokimia, Fakultas Peternakan dan Pertsnian,
Universitas Diponegoro, Semarang.
Materi dalam
Praktikum Mikrobiologi meliputi bahan yaitu agar-agar, ekstrak kentang, dextrose, aquades, asam tartarat,
kertas pembungkus, kapas, alkohol, aluminium foil, sampel bakteri yang akan
dihitung, medium, larutan gram (A (violet krista), B (lugol), C (etanol) dan D (safranin)) untuk pewarnaan gram, dan
biakan bakteri serta alat yang digunakan adalah timbangan untuk
menimbang medium kentang, erlenmeyer untuk mereaksikan
bahan, waterbath untuk memasak/merebus kentang, beker glassuntuk
memasak kentang, gelas ukur untuk mengukur kebutuhan air yang diperlukan, pisau
untuk memotong bahan, kain saring untuk membuat filtrat, pH meter untuk
mengukur kadar pH, oven untuk sterilisasi kering pada alat, autoklaf untuk
sterilisasi basah, cawan petri sebagai tempat pembuatan medium, pipet hisap untuk
mengambil sampel, tabung reaksi untuk mereaksikan bahan, pipet untuk memipet
sampel dan pereaksi, bunsen untuk mensterilkan dan memanaslan alat serta bahan,
kaca objek untuk menempatkan objek, loop untuk memperbesar gambar dan
mikroskop untuk memperbesar gambar yang sangat kecil.
Tujuan dari
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium adalah memahami dan mampu melaksanakan
percobaan sterilisasi alat berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan
metode terilisasi kering, serta mampu membuat medium Potato Dextrose
Agar (PDA) dengan menggunakan kentang yang
diekstraksi. Pada Praktikum Mikrobiologi dengan materi Metode Hitung Cawan dan
Pewarnaan Bakteri, mahasiswa memahami dan mampu melaksanakan perhitungan
bakteri menggunakan loop serta mampu melakukan pewarnaan gram menggunakan gram
A (violet krista), gram B (lugol), gram C (etanol), dan gram D (safranin) pada
bakteri Lactobacillus acidophilus.
Kata Kunci : Sterilisasi, Pembuatan Medium, Perhitungan Jumlah
Mikroba, Pewarnaan Gram
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR................................................................................ iv
DAFTAR TABEL....................................................................................... v
DAFTAR ILUSTRASI...............................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................
vii
BAB I PENDAHULUAN..........................................................................
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................
2.1. Sterilisasi............................................................................
2.2. Pembuatan
Medium...........................................................
2.3. Metode Hitungan Cawan..................................................
2.4. Morfologi
Bakteri..............................................................
2.5. Pewarnaan
Gram...............................................................
BAB III MATERI DAN METODE...........................................................
3.1. Materi...............................................................................
3.1.
Metode.............................................................................
BAB IV HASIL DAN
PEMBAHASAN.................................................
4.1.
Sterilisasi..........................................................................
4.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)..........
4.3. Penghitungan Jumlah
Mikroba.........................................
4.4. Pewarnaan
Gram..............................................................
BAB V SIMPULAN DAN
SARAN........................................................
5.1.
Simpulan...........................................................................
5.2.
Saran.................................................................................
DAFTAR
PUSTAKA................................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................
DAFTAR
TABEL
Halaman
Tabel 1. Anatomi Saluran Pencernaan Ruminansia........................... 1
DAFTAR
ILUSTRASI
Ilustrasi Halaman
1. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Positif Pebesaran 1000 kali
2. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Negatif Perbesaran 1000 kali
DAFTAR
LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gambar
dan Fungsi Alat
2. Perhitungan
SPC (Standart Plate Count)
3. Fotocopy
Laporan Hasil Praktikum
BAB I
PENDAHULUAN
Mikrobiologi
merupakan suatu telaah studi mengenai mikroorganisme. Mikroorganisme merupakan
organisme hidup yang berukuran kecil yang hanya dapat dilihat secara
mikroskopis. Mikroorganisme yang ada di alam terdiri dari berbagai macam jenis
dan jumlahnya tidak terbatas. Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak
dimana saja dengan syarat cukup nutrien dan berkembang pada mรฉdium yang tepat.
Medium dapat berupa mรฉdium cair, mรฉdium padat dan mรฉdium setengah padat.
Mikroorganisme baik yang membentuk koloni atau tidak, saat berkembang pada
suatu medium dapat diketahui jumlahnya dengan beberapa metode salah satunya
adalah metode hitungan cawan. Mikroorganisme ada yang memiliki sifat
menguntungkan dan ada juga yang bersifat merugikan, untuk mengetahuinya dapat
dilakukan serangkaian pengujian melalui pewarnaan mikroorganisme.
Tujuan dari praktikum
mikrobiologi ini yaitu untuk mengetahui cara pembuatan medium dan larutan
pengencer, cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan
cawan dan cara pewarnaan gram positif maupun negatif. Manfaat dari praktikum
mikrobiologi ini adalah mengetahui cara pembuatan medium dan larutan pengencer,
cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan cawan serta
mengetahui cara pewarnaan gram positif maupun negatif.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Sterilisasi
Sterilisasi
medium memerlukan lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi
alat-alat, yakni 15 menit, tetapi menggunakan suhu dan tekanan yang sama
(Hendaryono dan Ari, 1994). Bahan yang dapat disterilkan dengan autoklaf adalah
media biakan, larutan, kapas, dan peralatan laboratorium (Gunawan, 2000).
Sterilisasi adalah suatu proses yang menghancurkan semua bentuk kehidupan.
Setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang mematikan semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2007).
Suatu benda yang steril dipandang dari sudut mikrobiologi, artinya bebas dari
mikroorganisme hidup. Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan uap panas,
larutan kimia, pemanasan kering atau metode gas (Adji et al., 2007).
2.1.1
Sterilisasi
Kering
Sterilisasi dengan
panas kering atau udara panas dianjurkan apabila penggunaan uap bertekanan yang
akan disterilkan. Hal ini berlaku bagi peralatan laboratorium seperti cawan
petri, pipet hisap, juga peralatan lainnya. Benda-benda ini kemudian disterilkan
dalam oven listrik atau gas dengan suhu 1600C selama 2 jam (Pelczar et
al., 1988). Sterilisasi alat dan media dilakukan dengan menggunakan oven yang
digunakan untuk mensterilkan cawan petri dan pipet volume. Penggunaan alat ini
dengan cara memasukkan alat-alat tersebut dalam oven dan dipanaskan dengan suhu
1600-1700C selama 1-2 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.1.2
Sterilisasi
Basah
Sterilisasi basah biasanya menggunakan alat autoklaf
yaitu serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Autoklaf biasanya
digunakan untuk mensterilkan medium baik yang berasal dari agar maupun dari air
susu. Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan.
Alat-alat yang berupa glass ware
maupun dissecting kit sebelum
digunakan harus disterilkan dahulu. Demikian juga medium yang sudah dimasukkan
ke dalam botol medium harus disterilkan juga (Hendaryono dan Ari, 1994).
Sterilisasi alat dan media yang dilakukan dengan menggunakan autoclaf untuk mensterilkan tabung
reaksi bertutup dan erlenmayer. Penggunaan alat ini dengan memasukkan alat-alat
tersebut kedalam autoklaf yang ditutup dengan rapat dan menyalakan autoklaf
dengan temperatur 1200C dan tekanan antara 15-7,5 psi (pound per squareinci) atau 1 atm selama
1 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.2
Pembuatan
Medium
Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin laboratorium ialah kaldu
cair dan kaldu agar (Dwidjoseputro, 2005). Pembuatan medium dapat dilakukan
dengan cara menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti,
kemudian mencampurkannya, melarutkannya di dalam air, mengatur keasaman,
memasukkan ke dalam tabung, dan mensterilkan menggunakan autoklaf pada suhu dan
waktu yang telah ditetapkan (Fardiaz, 1989).
2.2.1
Medium Nutrien Agar (NA)
Media padat NA
dibuat dengan cara melarutkan NA sebanyak 2 gram dalam 100 mL aquades. Larutan
dipanaskan sambil diaduk agar bubuk NA dapat larut sempurna. Setelah larut
media ini dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan cawan petri. Untuk tabung
reaksi mulut tabung ditutup dengan kapas berlemak yang telah dibungkus dengan
kasa steril. Media tersebut kemudian disterilkan dengan autoklaf pada 1210C
selama 15 menit. Media padat disimpan dalam inkubator sampai memadat
(Buditianingsih et al., 2010). Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) sebanyak 200
mL 0,6 g Beef extract + 1 g Pepton +
3 g Agar dimasukkan dalam erlenmayer dan cukupkan volumenya dengan aquades 200
mL, kemudian dimasak dalam air mendidih selama 15 menit, lalu disterilkan dlam
autoklaf (Pratiwi, 2005).
2.2.2
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Jumlah fungi dalam makanan dapat dihitung dengan
metode hitungan cawan menggunakan medium Potato
Dextrose Agar (PDA). Biasanya pembuatan biakan murni menggunakan media PDA
yang tersusun oleh kentang, gula dalam bentuk dextrose, agar-agar dan aquades (Warisno dan Dahana, 2009). PDA
adalah suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup,
yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa, sehingga baik untuk
pertumbuhan fungi tetati kurang baik untuk pertumbuhan bakteri, akan tetapi karena
beberapa bakteri juga memfermentasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai
sumber energi, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh pada Potato Dextrose Agar (PDA) (Aprintasari
et al., 2012).
2.2.3
Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Medium padat atau solid medium adalah
medium yang berbentuk padat dan
mengandung 1,5 – 1,8% agar misalnya terdapat pada Acidified Potato Dextrose Agar
(Fardiaz, 1993). Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme
terdapat dalam bentuk padat setengah padat dan cair. Medium padat contoh APDA
mengandung karbohidrat kompleks dan agar-agar dari alga merah serta mengandung
APDA tersebut mengandung molekul organik kompleks untuk pertumbuhan bakteri
(Schlegal, 1994).
2.3
Metode
Hitungan Cawan
2.3.1
Pengenceran
dan Metode Tuang (Pour Plate)
Pengenceran
bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari suatu bahan agar
setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya dapat dihitung
dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi paling baik yaitu
antara 30-300 koloni. Perbandingan dalam melakukan pengenceran biasanya dalam
bentuk desimal, misalnya 1:10 , 1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk melakukan pengenceran biasanya buffer fosfat, larutan garam
fisiologis 0,85%, larutan ringer juga aquades (Dwidjoseputro, 1993).
Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang
didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan
mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri
steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (Acidified Potato Dextrose
Agar) steril hangat dengan suhu antara 40 – 50°C, kemudian ditutup rapat dan
diletakkan dalam inkubator bersuhu 37°C selama 1 – 2 hari dengan posisi dibalik
(Megamii, 2009).
Metode penuangan dengan mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam
suatu medium dari kaldu atau gelatin encer. Setelah mengental, maka akan nampak
koloni-koloni yang dianggap murni. Metode ini ditemukan Robert Koch. Disamping
itu ada seorang lagi yang berjasa yaitu Petri, yang menemukan cawan petri
dibantu dengan Hasse yang menemukan agar-agar untuk menggatikan gelatin. Agar
lebih baik dari pada gelatin karena agar tidak lekas mencair dan memiliki titik
cair 95oC (Dwidjoseputro, 1989). Media
yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses
penuangan, media panas juga masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada
cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni
akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di
dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator selama 48
jam (Megamii, 2009).
2.3.2
Perhitungan
Mikroba Berdasarkan Standart Plate Count
(SPC)
Salah satu cara
penghitungan bakteri adalah dengan menggunakan metode hitung cawan atau Standard Plate Count (SPC). Prinsip
kerjanya adalah jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang
dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300
koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya,
maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni
dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991).
2.4
Morfologi
Bakteri
Bentuk umum
bakteri terdiri dari satu sel (uniseluler), bentuk lainnya berupa koloni yaitu
gabungan dua sel atau lebih di dalam satu ruang. Variasi bentuk bakteri yaitu
bulat (kokus), batang atau bulat memanjang (basil) dan lengkung (Ilyas, 2001
dalam Khairani, 2010). Bakteri dapat hidup dengan memanfaatkan makanan yang ada
di lingkungannya. Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk kelas Schizomycetes, berkembang biak secara
aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang
bersifat fotosintetik (Sumarsih, 2003).
2.4.1
Bakteri
Gram Positif
Dinding
sel bakteri gram positif terdiri atas 40 lapis rangka dasar murein, yang
meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun
dinding sel gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan
asam teikoat yang sangat spesifik (Sumarsih, 2003). Berdasarkan komposisi
dinding sel bakteri, dinding sel bakteri gram positif mengandung 90%
peptidoglikan selebihnya adalah asam teikoat. Sel bakteri gram positif terlihat
berwarna ungu, disebabkan karena bakteri tersebut dapat membentuk ikatan
komplek dengan pewarna gram (Nursanty et al., 2013). Bakteri kelompok gram positif bersifat
menguntungkan karena bisa menjadi probiotik bagi ternak ayam (Manin, 2010). Lactobacillus caseii dan Lactobacillus bulgaricus merupakan probiotik yangtergolong kepada bakteri baik (Pangkalan
Ide, 2008).
2.4.2
Bakteri
Gram Negatif
Dinding sel
bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan
hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung
diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut
terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain.
Senyawa-senyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak
terdapat dalam dinding sel ini (Sumarsih, 2003). Dinding sel bakteri gram
negatif terdiri dari 5- 20% peptidoglikan, selebihnya adalah polisakarida. Pada
sel bakteri gram negatif pemberian larutan alkohol 95% dapat meningkatkan
porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar sehingga
komplek ungu kristal-iodium akan terlepas dan sel menjadi tidak berwarna. Selanjutnya
sel akan berwarna merah disebabkan karena terwarnai oleh warna safranin
(Nursanty et al., 2013). Salah satu
contoh bakteri gram negatif yaitu Escherichia
coli (Ferdiaz,1989).
2.5
Pewarnaan
Gram
Pewarnaan gram
berguna untuk membedakan gram positif dan gram negatif. Pembeda hasil pewarnaan
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur kedua kelompok bakteri tersebut
sehingga menyebakan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna (Lay dalam
Chaerani, 2010). Karakterisasi bakteri dapat dilakukan menggunakan zat warna
kristal violet dan safranin (Khairani, 2010). Bahan untuk uji
pewarnaan Gram (crystal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol 95%,
dan aquades) (Campbell et
al.,2004).
BAB III
MATERI DAN METODE
Praktikum
Mikrobiologi yang dilaksanakan pada hari Kamis
tanggal 22 Mei 2014 pukul 11.00-14.00 WIB dengan materi Sterilisasi, Medium dan Larutan Pengenceran
serta pada hari Jum’at tanggal 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB dengan materi Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram yang di laksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro,
Semarang.
3.1
Materi
Alat yang
digunakan dalam praktikum mikrobiologi ini adalah timbangan yang berfungsi
untuk menimbang sampel, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat menyimpan
larutan, kain saring yang berfungsi untuk menyaring kentang untuk diambil
filtratnya, kompor listrik yang berfungsi untuk mendidihkan air, oven dan
autoklaf yang berfungsi untuk memanaskan alat-alat praktikum, pengaduk magnetik
yang berfungsi untuk mengaduk medium, cawan petri yang berfungsi sebagai tempat
mikroba ditumbuhkan, pipet hisap yang berfungsi untuk memindahkan larutan dalam
ukuran kecil, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat larutan, kaca objek
sebagai tempat sampel yang akan diamati, bunsen untuk memanaskan objek,
mikroskop yang berfungsi untuk mengamati bakteri dengan perbesaran tertentu,
alat tulis dan buku panduan praaktikum yang berfungsi untuk mencatat hasil
pengamatan. Sedangkan bahan yang digunakan adalah kentang yang telah dipotong
berbentuk dadu, dextrose, agar,
aquades, alkohol, susu UHT, medium, larutan gram A (ungu kristal 90%, etanol
95%, amonium oksalat dan aquades). Larutan gram B (kristal iodium, kalium
iodida dan aquadest), larutan gram C (etanol 95 %), dan larutan gram D (larutan
safranin dan aquadest ), dan biakan bakteri, Escherichia coli dan Lactobacillus
acidophilus.
3.2
Metode
3.2.1
Sterilisasi
3.2.1.1
Sterilisasi
Kering
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan pipet, cawan petri serta
alat gelas lainnya sesuai dengan kebutuhan. Kemudian membersihkan cawan petri
menggunakan kapas dengan membasahi menggunakan alkohol untuk menghilangkan
lemak dan kotoran yang menempel pada cawan petri, kemudian membungkusnya dengan
kertas pembungkus. Membersihkan pipet volum serta menyumbat bagian pangkal
pipet menggunakan kapas, kemudian membungkusnya menggunakan kertas pembungkus.
Memasukan cawan petri, pipe dan erlenmeyer pada oven selama 1 jam dengan suhu
170oC. Setelah selesai, mengeluarkan cawan petri dan pipet dari oven, tunggu
hingga suhu turun sebelum menggunakannya.
3.2.1.2
Sterilisasi Basah
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama memasukkan medium sebelum
mensrterilkannya kedalam erlenmeyer serta larutan pengencer kemudian tutup
rapat menggunakan kapas. Memasukan erlenmeyer dan tabung reaksi ke dalam autoclave, kemudian menutup autoclave hingga rapat, menyalakan autoclave, menunggu hinga manometer dan
termometer menunjukan tanda sterilisasi atau pada suhu 1210C dengan
tekanan 2 atm, mendiamkannya selama 15 menit. Setelah 15 menit menunggu hingga
tekanan autoclave berkisar 0,5 atm,
membuka katup pengaman dan membiarkan hingga autoclave tidak bertekanan, setelah itu membuka autoclave dan medium. Untuk medium
berupa agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku maka
memasukannya kedalam inkubator bersuhu 550C, sebelum digunakan.
3.2.2
Pembuatan
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Menimbang
kentang sebanyak 250 g. Memasukan kentang kedalam beker glass, kemudian
menambahkan 500 ml aquades, lalu menutupnya menggunakan aluminium foil serapat
mungkin. Memanaskannya diatas pemanas hingga mendidih. Mengambil filtrat
kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Setelah filtrat
terkumpul, mengukur volumenya untuk membuat PDA dengan komposisi 100 ml filtrat
kentang, 2 g dextrose, 2 g agar serta
pH 6,8 – 7,2.
3.2.3
Penghitungan
Jumlah Mikroba
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan serta memberi label
larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran dan
pemupukan. Melakukan pengenceran hingga tingkat
pengenceran yang ditentukan. Kemudian melakukan
pencawanan pada tiga tingkat pengenceran terakhir. Selanjutnya menuangkan 10 ml medium agar kedalam
cawan petri kemudian menggoyangkannya membentuk angka delapan hingga sampel
merata. Setelah medium membeku, melakukan inkubasi dengan posisi terbalik pada
suhu ruangan selama 24 – 48 jam. Menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada
cawan dan melaporkan jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.
3.2.4
Pewarnaan
Gram
Mengambil kaca
objek atau preparat lalu memberikan setetes aquades pada kaca. Mengambil
sejumlah mikroba pada ujung loop fiksasi dengan nyala api kecil pada bunse.
Meneteskan violet kristal (gram A) di atas preparat diamkan selama 1 menit.
Membilas dengan aquades lalu membuang sisa air yang tertinggal dan menetesi
dengan larutan lugol (gram B) kemudian didiamkan selama 2 menit. Membilas
dengan aquades kemudian menghilangkan warna dengan gram C sampai warna biru
tidak luntur lagi. Membilas kembali dengan aquades kemudian menetesi dengan
safranin (gram D) diamkan selama 30 detik lalu membilas dengan air dan
mengeringkan dengan menggunakan tisu. Mengamati kaca objek pada mikroskop
dengan perbesaran 100x.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Sterilisasi
4.1.1
Sterilisasi Kering
Berdasarkan
hasil praktikum yang telah dilakukan sterilisasi alat
berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan oven memiliki tujuan untuk
menghilangkan bakteri yang menempel pada alat. Sterilisasi menggunakan
oven merupakan sterilisasi kering berupa panas kering. Hal ini sesuai pendapat
Antonius (2006) bahwa sterilisasi ada berbagai macam salah satunya secara
fisika yaitu dengan panas kering (Hot Air
Oven).Mencuci pipet hisap dan cawan petri menggunakan alkohol dan membasuh
dengan kapas sebelum memasukkan ke dalam oven. Menyumbat alat pipet pada
salah satu ujungnya, supaya tidak terjadi perpindahan udara dan bakteri melalui
rongga pipet. Membungkus alat menggunakan kertas supaya tidak ada kontaminasi
bakteri luar dan kemudian memasukkan ke dalam oven. Sterilisasi menggunakan
oven ini, menerapkan suhu 1600C
selama 2 jam. Tujuannya, untuk mematikan bakteri karena rata-rata bakteri mati
pada suhu 100 oC, maka bakteri di dalam bungkus kertas dapat
mati dan alat-alat menjadi steril. Hal ini diperkuat dengan
pendapat Darwis (2006) bahwa sterilisasi adalah suatu proses untuk
menghilangkan atau menginaktivasi mikroorganisme hidup.
4.1.2
Sterilisasi Basah
Sterilisasi
panas basah (autoklaf), yaitu dengan menggunakan medium basah dan dipanaskan
dengan suhu 1210C.
Sterilisasi ini cukup singkat waktunya, jika membandingkan dengan sterilisasi
kering. Hal ini sesuaidengan pendapat Antonius (2006) bahwa
secara teori prosedur sterilisasi memakai autoklaf dikatakan lebih efektif
karena suhunya lebih rendah, dan waktu yang diperlukan lebih singkat selain itu daya bunuh pada mikroorganisme juga lebih tinggi. Hal
ini diperkuat oleh pendapat Hadioetomo (2003) bahwa sterilisasi
menggunakan autoklaf dilaksanakan dengan suhu 1210C selama 15 menit. Cara
kerja autoklaf, yaitu menggunakan tekanan tinggi, sehingga bakteri mati dan
alat-alat menjadi steril.
4.2 Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
Pada pembuatan Medium
PDA, menggunakan ekstrak kentang 100 ml dan menambahkan 6 gram agar dan 2 gram dextrose.
Hal ini sesuai dengan pendapat Yuliar (2008), yang menyatakan bahwa pembuatan
media PDA dibuat dengan melarutkan agar ke dalam akuades (9 x filtrat) dan disterilisasi
menggunakan auotoklaf kemudian dituang ke dalam cawan petri. Langkah selajutnya
menginkubasi selama satu hari, untuk membiakkan bakteri. Berdasarkan hasil
praktikum yang telah dilakukan, praktikum pembuatan medium untuk menumbuhkan
mikroba telah berhasil menumbuhkan bakteri, hal ini ditandai dengan timbulnya
beberapa koloni pada cawan petri. Tumbuhnya mikroba dalam medium menandakan
bahwa medium PDA yang dibuat sesuai dengan prosedur dan memiliki kandungan
nutrien yang cukup untuk tumbuhnya mikroba. Namun, koloni belum terbentuk
secara sempurna. Hal ini disebabkan waktu inkubasi kurang lama atau suhu yang
dibutuhkan mikroba untuk membentuk koloni kurag optimum atau dapat dikatakan
suhu berpengaruh pada pembentukan koloni. Hal ini sesuai pendapat llyas dalam
Khairani (2010) bahwa bentuk dan jumlah pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh
lingkungan yang tidak mengutungkan, faktor makanan dan suhu.
4.3 Penghitungan Jumlah Mikroba
Berdasarkan
praktikum yang telah dilakukan diperoleh hasil sebgai berikut :
Tabel 1. Hasil Perhitungan
Koloni Bakteri
|
Medium
|
Pengenceran
|
SPC
|
||
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
||
|
PDA
|
130
|
50
|
37
|
1,3 x 10-4
|
Sumber : Data Primer Praktikum
Mikrobiologi, 2014
Pada hasil
percobaan yang dilakukan pengenceran sebanyak 3 kali, terlihat pada cawan
pertumbuhan dari koloni tidak terlalu rapat. Sebanyak 130 koloni
bakteri terlihat pada pengenceran 10-3 ,
sedangkan pada pengenceran 10-4 terlihat
50 koloni
bakteri, dan sebanyak 37
koloni bakteri terlihat pada pengenceran 10-5. Hal ini kemudian diperkuat dengan pendapat
Harmita dan Maksum (2008) yang menyatakan bahwa pertumbuhan bakteri yang terlalu rapat,
hasilnya akan sulit dipertanggungjawabkan. Demikian juga untuk pertumbuhan yang
terlalu jarang sehingga diperlukan pemilihan cawan petri yang pertumbuhan
koloni bakterinya paling layak untuk
dihitung, yang biasanya diambil dari cawan petri yang pertumbuhan koloninya
berkisar 30-300 koloni per cawan petri. Dalam hal ini Chang (2003)
menambahkan bahwa dalam melakukan proses pengenceran, penambahan lebih banyak
pelarut ke dalam sejumlah tertentu larutan stok akan mengubah (mengurangi)
konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat pelarut yang terdapat dalam
larutan, dengan kata lain mol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan mol
zat terlarut setelah pengenceran.
4.4. Pewarnaan Gram
4.4.1 Lactobacillus
acidophilus
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Lactobacillus acidophilus
diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Lactobacillus
acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
|
|
|
|
Bentuk : Bacil
Warna : Biru keunguan
Gram : B
(Positif)
|
Bentuk : Bacil
Warna : ungu
Gram : B (Positif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Berdasarkan
hasil pengamatan pada percobaan pewarnaan gram terhadap bakteri Lactobacillus didapatkan warna ungu
dan berbentuk bacillus. Hal ini
sesuai dengan pendapat Dwijoseputro (2004), yang menyatakan bahwa
bakteri berdasarkan morfoginya bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga
golongan yaitu basil, kokus dan spiril. Basil (bacillus) dan bakteri lactobacillus
ini berbentuk batang, bervariasi
panjang dan ramping. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi gram positif dan
negatif, hal sesuai dengan pendapat Agustina et al., (2013) yang
menyatakan bahwa pewarnaan grampositif adalah yang mempunyai zat warna asli
yaitu ungu jika di tetesi, dan gram positif lebih peka terhadap fenol,
penisilin, dan resisten terhadap streptomisinin. Dan gram negatif berwarna
merah karena yang demikian ini dinamai gram variabel.
4.4.2 Escherichia
coli
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Escherichia
coli diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Escherichia
coli
|
Escherichia coli
|
Escherichia coli
|
|
|
|
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A
(negatif)
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A (negatif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Pada percobaan pewarnaan gram pada
bakteri Escherichia coli dengan menggunakan pewarna
gram berupa violet krista, lugol, etanol serta safranin, didapatkan hasilnya adalah warna
merah. Hal ini menunjukkan bahwa sifat dari bakteri ini adalah gram negatif.
Pada saat mengamati menggunakan mikroskop, menunjukkan adanya sifat dari bakteri Esterechia coli yang menyendiri dan
sebagian berkelompok membentuk koloni. Bentuk yang nampak yaitu bulat-bulat
kecil dan merata. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Sousa (2006) yang
menyatakan bahwa Escherichia coli merupakan
bakteri non-spora berbentuk bulat. Hal
yang sama dijelaskan oleh
Melliawati (2009) bahwa secara umum E. coli bentuk bulat cenderung ke batang panjang. Pada bentuk
batang, biasanya berukuran 0,5 x 1 - 3 ยต. terdapat yang sendiri-sendiri, berpasang-pasangan dan
rangkaian pendek, biasanya tidak membentuk spora, merupakan bakteri gram
negatif, merupakan parasit dalam saluran pencernaan makanan manusia dan hewan
berdarah panas, serta koloninya ditemukan dalam feses.
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1
Simpulan
Hasil praktikum
mikrobiologi dapat disimpulkan, bahwa metode sterilisasi terdiri dari dua
jenis, dapat dilakukan dengan sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Bakteri dapat dikembangbiakkan melalui medium agar, PDA serta dapat
diketahui ciri-cirinya melalui pewarnaan gram dan melihat melalui mikroskop. Bakteri
dapat dihitung jumlah koloninya, dengan bantuan loop dan counter. Jenis
bakteri, dapat diidentifikasi menggunakan pewarna gram, sehingga diperoleh
hasil gram positif dan gram negatif. Lactobacillus acidophilus merupakan
bakteri gram positif, sedangkan Escherichia
coli merupakan bakteri gram negatif.
5.2
Saran
Diharapkan
pada praktikan lebih memperhatikan ketersediaan alat serta bahan yang akan
digunakan dalam praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan baik, serta
diharapkan melakukan pengecekan terhadap alat-alat yang akan digunakan sehingga
tidak terjadi kerusakan yang dapat berakibat fatal. Dan tidak lupa meningkatkan
komunikasi antara praktikan dan asisten.
STERILISASI,
PEMBUATAN MEDIUM, PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA, DAN PEWARNAAN GRAM
Disusun
oleh :
Kelompok
VIIB
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
Nama
NIM
JURUSAN
S-1 PETERNAKAN
FAKULTAS
PETERNAKAN DAN PERTANIAN
UNIVERSITAS
DIPONEGORO
SEMARANG
LEMBAR
PENGESAHAN
Judul : LAPORAN
RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Kelompok : IIIF (TIGA)F
Jurusan : S-1 PETERNAKAN
Fakultas : PETERNAKAN DAN
PERTANIAN
Tanggal Pengesahan : .... Juni 2014
Menyetujui,
|
Koordinator Asisten
Praktikum Mikrobiologi
Jenny Febrianti
NIM. 23010111120031
|
Asisten Pembbimbing
Nama
Nim
|
|
|
|
|
|
|
Mengetahui,
Koordinator Umum Mikrobiologi
Dr. Dra. Turrini Yudiarti, M.Sc.
NIP. 19591202 198703 2 002
RINGKASAN
Kelompok IIIF. 2014. Laporan resmi Praktikum
Mikrobiologi (Asisten : SANTI SULISTIANI).
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 22
Mei 2014 pukul 11.00 – 12.00 WIB dan materi Metode Hitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram pada hari Jum’at tanggal. 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB di
Laboratorium Fisiologi dan Biokimia, Fakultas Peternakan dan Pertsnian,
Universitas Diponegoro, Semarang.
Materi dalam
Praktikum Mikrobiologi meliputi bahan yaitu agar-agar, ekstrak kentang, dextrose, aquades, asam tartarat,
kertas pembungkus, kapas, alkohol, aluminium foil, sampel bakteri yang akan
dihitung, medium, larutan gram (A (violet krista), B (lugol), C (etanol) dan D (safranin)) untuk pewarnaan gram, dan
biakan bakteri serta alat yang digunakan adalah timbangan untuk
menimbang medium kentang, erlenmeyer untuk mereaksikan
bahan, waterbath untuk memasak/merebus kentang, beker glassuntuk
memasak kentang, gelas ukur untuk mengukur kebutuhan air yang diperlukan, pisau
untuk memotong bahan, kain saring untuk membuat filtrat, pH meter untuk
mengukur kadar pH, oven untuk sterilisasi kering pada alat, autoklaf untuk
sterilisasi basah, cawan petri sebagai tempat pembuatan medium, pipet hisap untuk
mengambil sampel, tabung reaksi untuk mereaksikan bahan, pipet untuk memipet
sampel dan pereaksi, bunsen untuk mensterilkan dan memanaslan alat serta bahan,
kaca objek untuk menempatkan objek, loop untuk memperbesar gambar dan
mikroskop untuk memperbesar gambar yang sangat kecil.
Tujuan dari
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi dan Pembuatan Medium adalah memahami dan mampu melaksanakan
percobaan sterilisasi alat berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan
metode terilisasi kering, serta mampu membuat medium Potato Dextrose
Agar (PDA) dengan menggunakan kentang yang
diekstraksi. Pada Praktikum Mikrobiologi dengan materi Metode Hitung Cawan dan
Pewarnaan Bakteri, mahasiswa memahami dan mampu melaksanakan perhitungan
bakteri menggunakan loop serta mampu melakukan pewarnaan gram menggunakan gram
A (violet krista), gram B (lugol), gram C (etanol), dan gram D (safranin) pada
bakteri Lactobacillus acidophilus.
Kata Kunci : Sterilisasi, Pembuatan Medium, Perhitungan Jumlah
Mikroba, Pewarnaan Gram
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR................................................................................ iv
DAFTAR TABEL....................................................................................... v
DAFTAR ILUSTRASI...............................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................
vii
BAB I PENDAHULUAN..........................................................................
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................
2.1. Sterilisasi............................................................................
2.2. Pembuatan
Medium...........................................................
2.3. Metode Hitungan Cawan..................................................
2.4. Morfologi
Bakteri..............................................................
2.5. Pewarnaan
Gram...............................................................
BAB III MATERI DAN METODE...........................................................
3.1. Materi...............................................................................
3.1.
Metode.............................................................................
BAB IV HASIL DAN
PEMBAHASAN.................................................
4.1.
Sterilisasi..........................................................................
4.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)..........
4.3. Penghitungan Jumlah
Mikroba.........................................
4.4. Pewarnaan
Gram..............................................................
BAB V SIMPULAN DAN
SARAN........................................................
5.1.
Simpulan...........................................................................
5.2.
Saran.................................................................................
DAFTAR
PUSTAKA................................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................
DAFTAR
TABEL
Halaman
Tabel 1. Anatomi Saluran Pencernaan Ruminansia........................... 1
DAFTAR
ILUSTRASI
Ilustrasi Halaman
1. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Positif Pebesaran 1000 kali
2. Gambar
Pengamatan Bakteri Gram Negatif Perbesaran 1000 kali
DAFTAR
LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gambar
dan Fungsi Alat
2. Perhitungan
SPC (Standart Plate Count)
3. Fotocopy
Laporan Hasil Praktikum
BAB I
PENDAHULUAN
Mikrobiologi
merupakan suatu telaah studi mengenai mikroorganisme. Mikroorganisme merupakan
organisme hidup yang berukuran kecil yang hanya dapat dilihat secara
mikroskopis. Mikroorganisme yang ada di alam terdiri dari berbagai macam jenis
dan jumlahnya tidak terbatas. Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak
dimana saja dengan syarat cukup nutrien dan berkembang pada mรฉdium yang tepat.
Medium dapat berupa mรฉdium cair, mรฉdium padat dan mรฉdium setengah padat.
Mikroorganisme baik yang membentuk koloni atau tidak, saat berkembang pada
suatu medium dapat diketahui jumlahnya dengan beberapa metode salah satunya
adalah metode hitungan cawan. Mikroorganisme ada yang memiliki sifat
menguntungkan dan ada juga yang bersifat merugikan, untuk mengetahuinya dapat
dilakukan serangkaian pengujian melalui pewarnaan mikroorganisme.
Tujuan dari praktikum
mikrobiologi ini yaitu untuk mengetahui cara pembuatan medium dan larutan
pengencer, cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan
cawan dan cara pewarnaan gram positif maupun negatif. Manfaat dari praktikum
mikrobiologi ini adalah mengetahui cara pembuatan medium dan larutan pengencer,
cara sterilisasi, menghitung jumlah bakteri dengan metode hitungan cawan serta
mengetahui cara pewarnaan gram positif maupun negatif.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Sterilisasi
Sterilisasi
medium memerlukan lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi
alat-alat, yakni 15 menit, tetapi menggunakan suhu dan tekanan yang sama
(Hendaryono dan Ari, 1994). Bahan yang dapat disterilkan dengan autoklaf adalah
media biakan, larutan, kapas, dan peralatan laboratorium (Gunawan, 2000).
Sterilisasi adalah suatu proses yang menghancurkan semua bentuk kehidupan.
Setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang mematikan semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2007).
Suatu benda yang steril dipandang dari sudut mikrobiologi, artinya bebas dari
mikroorganisme hidup. Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan uap panas,
larutan kimia, pemanasan kering atau metode gas (Adji et al., 2007).
2.1.1
Sterilisasi
Kering
Sterilisasi dengan
panas kering atau udara panas dianjurkan apabila penggunaan uap bertekanan yang
akan disterilkan. Hal ini berlaku bagi peralatan laboratorium seperti cawan
petri, pipet hisap, juga peralatan lainnya. Benda-benda ini kemudian disterilkan
dalam oven listrik atau gas dengan suhu 1600C selama 2 jam (Pelczar et
al., 1988). Sterilisasi alat dan media dilakukan dengan menggunakan oven yang
digunakan untuk mensterilkan cawan petri dan pipet volume. Penggunaan alat ini
dengan cara memasukkan alat-alat tersebut dalam oven dan dipanaskan dengan suhu
1600-1700C selama 1-2 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.1.2
Sterilisasi
Basah
Sterilisasi basah biasanya menggunakan alat autoklaf
yaitu serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Autoklaf biasanya
digunakan untuk mensterilkan medium baik yang berasal dari agar maupun dari air
susu. Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan.
Alat-alat yang berupa glass ware
maupun dissecting kit sebelum
digunakan harus disterilkan dahulu. Demikian juga medium yang sudah dimasukkan
ke dalam botol medium harus disterilkan juga (Hendaryono dan Ari, 1994).
Sterilisasi alat dan media yang dilakukan dengan menggunakan autoclaf untuk mensterilkan tabung
reaksi bertutup dan erlenmayer. Penggunaan alat ini dengan memasukkan alat-alat
tersebut kedalam autoklaf yang ditutup dengan rapat dan menyalakan autoklaf
dengan temperatur 1200C dan tekanan antara 15-7,5 psi (pound per squareinci) atau 1 atm selama
1 jam (Kharisma dan Abdul, 2012).
2.2
Pembuatan
Medium
Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin laboratorium ialah kaldu
cair dan kaldu agar (Dwidjoseputro, 2005). Pembuatan medium dapat dilakukan
dengan cara menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti,
kemudian mencampurkannya, melarutkannya di dalam air, mengatur keasaman,
memasukkan ke dalam tabung, dan mensterilkan menggunakan autoklaf pada suhu dan
waktu yang telah ditetapkan (Fardiaz, 1989).
2.2.1
Medium Nutrien Agar (NA)
Media padat NA
dibuat dengan cara melarutkan NA sebanyak 2 gram dalam 100 mL aquades. Larutan
dipanaskan sambil diaduk agar bubuk NA dapat larut sempurna. Setelah larut
media ini dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan cawan petri. Untuk tabung
reaksi mulut tabung ditutup dengan kapas berlemak yang telah dibungkus dengan
kasa steril. Media tersebut kemudian disterilkan dengan autoklaf pada 1210C
selama 15 menit. Media padat disimpan dalam inkubator sampai memadat
(Buditianingsih et al., 2010). Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) sebanyak 200
mL 0,6 g Beef extract + 1 g Pepton +
3 g Agar dimasukkan dalam erlenmayer dan cukupkan volumenya dengan aquades 200
mL, kemudian dimasak dalam air mendidih selama 15 menit, lalu disterilkan dlam
autoklaf (Pratiwi, 2005).
2.2.2
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Jumlah fungi dalam makanan dapat dihitung dengan
metode hitungan cawan menggunakan medium Potato
Dextrose Agar (PDA). Biasanya pembuatan biakan murni menggunakan media PDA
yang tersusun oleh kentang, gula dalam bentuk dextrose, agar-agar dan aquades (Warisno dan Dahana, 2009). PDA
adalah suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup,
yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa, sehingga baik untuk
pertumbuhan fungi tetati kurang baik untuk pertumbuhan bakteri, akan tetapi karena
beberapa bakteri juga memfermentasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai
sumber energi, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh pada Potato Dextrose Agar (PDA) (Aprintasari
et al., 2012).
2.2.3
Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Medium padat atau solid medium adalah
medium yang berbentuk padat dan
mengandung 1,5 – 1,8% agar misalnya terdapat pada Acidified Potato Dextrose Agar
(Fardiaz, 1993). Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme
terdapat dalam bentuk padat setengah padat dan cair. Medium padat contoh APDA
mengandung karbohidrat kompleks dan agar-agar dari alga merah serta mengandung
APDA tersebut mengandung molekul organik kompleks untuk pertumbuhan bakteri
(Schlegal, 1994).
2.3
Metode
Hitungan Cawan
2.3.1
Pengenceran
dan Metode Tuang (Pour Plate)
Pengenceran
bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari suatu bahan agar
setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya dapat dihitung
dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi paling baik yaitu
antara 30-300 koloni. Perbandingan dalam melakukan pengenceran biasanya dalam
bentuk desimal, misalnya 1:10 , 1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk melakukan pengenceran biasanya buffer fosfat, larutan garam
fisiologis 0,85%, larutan ringer juga aquades (Dwidjoseputro, 1993).
Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang
didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan
mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri
steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (Acidified Potato Dextrose
Agar) steril hangat dengan suhu antara 40 – 50°C, kemudian ditutup rapat dan
diletakkan dalam inkubator bersuhu 37°C selama 1 – 2 hari dengan posisi dibalik
(Megamii, 2009).
Metode penuangan dengan mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam
suatu medium dari kaldu atau gelatin encer. Setelah mengental, maka akan nampak
koloni-koloni yang dianggap murni. Metode ini ditemukan Robert Koch. Disamping
itu ada seorang lagi yang berjasa yaitu Petri, yang menemukan cawan petri
dibantu dengan Hasse yang menemukan agar-agar untuk menggatikan gelatin. Agar
lebih baik dari pada gelatin karena agar tidak lekas mencair dan memiliki titik
cair 95oC (Dwidjoseputro, 1989). Media
yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses
penuangan, media panas juga masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada
cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni
akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di
dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator selama 48
jam (Megamii, 2009).
2.3.2
Perhitungan
Mikroba Berdasarkan Standart Plate Count
(SPC)
Salah satu cara
penghitungan bakteri adalah dengan menggunakan metode hitung cawan atau Standard Plate Count (SPC). Prinsip
kerjanya adalah jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang
dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300
koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya,
maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni
dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991).
2.4
Morfologi
Bakteri
Bentuk umum
bakteri terdiri dari satu sel (uniseluler), bentuk lainnya berupa koloni yaitu
gabungan dua sel atau lebih di dalam satu ruang. Variasi bentuk bakteri yaitu
bulat (kokus), batang atau bulat memanjang (basil) dan lengkung (Ilyas, 2001
dalam Khairani, 2010). Bakteri dapat hidup dengan memanfaatkan makanan yang ada
di lingkungannya. Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk kelas Schizomycetes, berkembang biak secara
aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang
bersifat fotosintetik (Sumarsih, 2003).
2.4.1
Bakteri
Gram Positif
Dinding
sel bakteri gram positif terdiri atas 40 lapis rangka dasar murein, yang
meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun
dinding sel gram positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan
asam teikoat yang sangat spesifik (Sumarsih, 2003). Berdasarkan komposisi
dinding sel bakteri, dinding sel bakteri gram positif mengandung 90%
peptidoglikan selebihnya adalah asam teikoat. Sel bakteri gram positif terlihat
berwarna ungu, disebabkan karena bakteri tersebut dapat membentuk ikatan
komplek dengan pewarna gram (Nursanty et al., 2013). Bakteri kelompok gram positif bersifat
menguntungkan karena bisa menjadi probiotik bagi ternak ayam (Manin, 2010). Lactobacillus caseii dan Lactobacillus bulgaricus merupakan probiotik yangtergolong kepada bakteri baik (Pangkalan
Ide, 2008).
2.4.2
Bakteri
Gram Negatif
Dinding sel
bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan
hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung
diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut
terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain.
Senyawa-senyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak
terdapat dalam dinding sel ini (Sumarsih, 2003). Dinding sel bakteri gram
negatif terdiri dari 5- 20% peptidoglikan, selebihnya adalah polisakarida. Pada
sel bakteri gram negatif pemberian larutan alkohol 95% dapat meningkatkan
porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar sehingga
komplek ungu kristal-iodium akan terlepas dan sel menjadi tidak berwarna. Selanjutnya
sel akan berwarna merah disebabkan karena terwarnai oleh warna safranin
(Nursanty et al., 2013). Salah satu
contoh bakteri gram negatif yaitu Escherichia
coli (Ferdiaz,1989).
2.5
Pewarnaan
Gram
Pewarnaan gram
berguna untuk membedakan gram positif dan gram negatif. Pembeda hasil pewarnaan
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur kedua kelompok bakteri tersebut
sehingga menyebakan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna (Lay dalam
Chaerani, 2010). Karakterisasi bakteri dapat dilakukan menggunakan zat warna
kristal violet dan safranin (Khairani, 2010). Bahan untuk uji
pewarnaan Gram (crystal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol 95%,
dan aquades) (Campbell et
al.,2004).
BAB III
MATERI DAN METODE
Praktikum
Mikrobiologi yang dilaksanakan pada hari Kamis
tanggal 22 Mei 2014 pukul 11.00-14.00 WIB dengan materi Sterilisasi, Medium dan Larutan Pengenceran
serta pada hari Jum’at tanggal 23 Mei 2014 pukul 09.00-11.00 WIB dengan materi Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan
Gram yang di laksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro,
Semarang.
3.1
Materi
Alat yang
digunakan dalam praktikum mikrobiologi ini adalah timbangan yang berfungsi
untuk menimbang sampel, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat menyimpan
larutan, kain saring yang berfungsi untuk menyaring kentang untuk diambil
filtratnya, kompor listrik yang berfungsi untuk mendidihkan air, oven dan
autoklaf yang berfungsi untuk memanaskan alat-alat praktikum, pengaduk magnetik
yang berfungsi untuk mengaduk medium, cawan petri yang berfungsi sebagai tempat
mikroba ditumbuhkan, pipet hisap yang berfungsi untuk memindahkan larutan dalam
ukuran kecil, erlenmayer yang berfungsi sebagai tempat larutan, kaca objek
sebagai tempat sampel yang akan diamati, bunsen untuk memanaskan objek,
mikroskop yang berfungsi untuk mengamati bakteri dengan perbesaran tertentu,
alat tulis dan buku panduan praaktikum yang berfungsi untuk mencatat hasil
pengamatan. Sedangkan bahan yang digunakan adalah kentang yang telah dipotong
berbentuk dadu, dextrose, agar,
aquades, alkohol, susu UHT, medium, larutan gram A (ungu kristal 90%, etanol
95%, amonium oksalat dan aquades). Larutan gram B (kristal iodium, kalium
iodida dan aquadest), larutan gram C (etanol 95 %), dan larutan gram D (larutan
safranin dan aquadest ), dan biakan bakteri, Escherichia coli dan Lactobacillus
acidophilus.
3.2
Metode
3.2.1
Sterilisasi
3.2.1.1
Sterilisasi
Kering
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan pipet, cawan petri serta
alat gelas lainnya sesuai dengan kebutuhan. Kemudian membersihkan cawan petri
menggunakan kapas dengan membasahi menggunakan alkohol untuk menghilangkan
lemak dan kotoran yang menempel pada cawan petri, kemudian membungkusnya dengan
kertas pembungkus. Membersihkan pipet volum serta menyumbat bagian pangkal
pipet menggunakan kapas, kemudian membungkusnya menggunakan kertas pembungkus.
Memasukan cawan petri, pipe dan erlenmeyer pada oven selama 1 jam dengan suhu
170oC. Setelah selesai, mengeluarkan cawan petri dan pipet dari oven, tunggu
hingga suhu turun sebelum menggunakannya.
3.2.1.2
Sterilisasi Basah
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama memasukkan medium sebelum
mensrterilkannya kedalam erlenmeyer serta larutan pengencer kemudian tutup
rapat menggunakan kapas. Memasukan erlenmeyer dan tabung reaksi ke dalam autoclave, kemudian menutup autoclave hingga rapat, menyalakan autoclave, menunggu hinga manometer dan
termometer menunjukan tanda sterilisasi atau pada suhu 1210C dengan
tekanan 2 atm, mendiamkannya selama 15 menit. Setelah 15 menit menunggu hingga
tekanan autoclave berkisar 0,5 atm,
membuka katup pengaman dan membiarkan hingga autoclave tidak bertekanan, setelah itu membuka autoclave dan medium. Untuk medium
berupa agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku maka
memasukannya kedalam inkubator bersuhu 550C, sebelum digunakan.
3.2.2
Pembuatan
Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Menimbang
kentang sebanyak 250 g. Memasukan kentang kedalam beker glass, kemudian
menambahkan 500 ml aquades, lalu menutupnya menggunakan aluminium foil serapat
mungkin. Memanaskannya diatas pemanas hingga mendidih. Mengambil filtrat
kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Setelah filtrat
terkumpul, mengukur volumenya untuk membuat PDA dengan komposisi 100 ml filtrat
kentang, 2 g dextrose, 2 g agar serta
pH 6,8 – 7,2.
3.2.3
Penghitungan
Jumlah Mikroba
Metode yang
dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan serta memberi label
larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran dan
pemupukan. Melakukan pengenceran hingga tingkat
pengenceran yang ditentukan. Kemudian melakukan
pencawanan pada tiga tingkat pengenceran terakhir. Selanjutnya menuangkan 10 ml medium agar kedalam
cawan petri kemudian menggoyangkannya membentuk angka delapan hingga sampel
merata. Setelah medium membeku, melakukan inkubasi dengan posisi terbalik pada
suhu ruangan selama 24 – 48 jam. Menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada
cawan dan melaporkan jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.
3.2.4
Pewarnaan
Gram
Mengambil kaca
objek atau preparat lalu memberikan setetes aquades pada kaca. Mengambil
sejumlah mikroba pada ujung loop fiksasi dengan nyala api kecil pada bunse.
Meneteskan violet kristal (gram A) di atas preparat diamkan selama 1 menit.
Membilas dengan aquades lalu membuang sisa air yang tertinggal dan menetesi
dengan larutan lugol (gram B) kemudian didiamkan selama 2 menit. Membilas
dengan aquades kemudian menghilangkan warna dengan gram C sampai warna biru
tidak luntur lagi. Membilas kembali dengan aquades kemudian menetesi dengan
safranin (gram D) diamkan selama 30 detik lalu membilas dengan air dan
mengeringkan dengan menggunakan tisu. Mengamati kaca objek pada mikroskop
dengan perbesaran 100x.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Sterilisasi
4.1.1
Sterilisasi Kering
Berdasarkan
hasil praktikum yang telah dilakukan sterilisasi alat
berupa pipet hisap dan cawan petri menggunakan oven memiliki tujuan untuk
menghilangkan bakteri yang menempel pada alat. Sterilisasi menggunakan
oven merupakan sterilisasi kering berupa panas kering. Hal ini sesuai pendapat
Antonius (2006) bahwa sterilisasi ada berbagai macam salah satunya secara
fisika yaitu dengan panas kering (Hot Air
Oven).Mencuci pipet hisap dan cawan petri menggunakan alkohol dan membasuh
dengan kapas sebelum memasukkan ke dalam oven. Menyumbat alat pipet pada
salah satu ujungnya, supaya tidak terjadi perpindahan udara dan bakteri melalui
rongga pipet. Membungkus alat menggunakan kertas supaya tidak ada kontaminasi
bakteri luar dan kemudian memasukkan ke dalam oven. Sterilisasi menggunakan
oven ini, menerapkan suhu 1600C
selama 2 jam. Tujuannya, untuk mematikan bakteri karena rata-rata bakteri mati
pada suhu 100 oC, maka bakteri di dalam bungkus kertas dapat
mati dan alat-alat menjadi steril. Hal ini diperkuat dengan
pendapat Darwis (2006) bahwa sterilisasi adalah suatu proses untuk
menghilangkan atau menginaktivasi mikroorganisme hidup.
4.1.2
Sterilisasi Basah
Sterilisasi
panas basah (autoklaf), yaitu dengan menggunakan medium basah dan dipanaskan
dengan suhu 1210C.
Sterilisasi ini cukup singkat waktunya, jika membandingkan dengan sterilisasi
kering. Hal ini sesuaidengan pendapat Antonius (2006) bahwa
secara teori prosedur sterilisasi memakai autoklaf dikatakan lebih efektif
karena suhunya lebih rendah, dan waktu yang diperlukan lebih singkat selain itu daya bunuh pada mikroorganisme juga lebih tinggi. Hal
ini diperkuat oleh pendapat Hadioetomo (2003) bahwa sterilisasi
menggunakan autoklaf dilaksanakan dengan suhu 1210C selama 15 menit. Cara
kerja autoklaf, yaitu menggunakan tekanan tinggi, sehingga bakteri mati dan
alat-alat menjadi steril.
4.2 Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
Pada pembuatan Medium
PDA, menggunakan ekstrak kentang 100 ml dan menambahkan 6 gram agar dan 2 gram dextrose.
Hal ini sesuai dengan pendapat Yuliar (2008), yang menyatakan bahwa pembuatan
media PDA dibuat dengan melarutkan agar ke dalam akuades (9 x filtrat) dan disterilisasi
menggunakan auotoklaf kemudian dituang ke dalam cawan petri. Langkah selajutnya
menginkubasi selama satu hari, untuk membiakkan bakteri. Berdasarkan hasil
praktikum yang telah dilakukan, praktikum pembuatan medium untuk menumbuhkan
mikroba telah berhasil menumbuhkan bakteri, hal ini ditandai dengan timbulnya
beberapa koloni pada cawan petri. Tumbuhnya mikroba dalam medium menandakan
bahwa medium PDA yang dibuat sesuai dengan prosedur dan memiliki kandungan
nutrien yang cukup untuk tumbuhnya mikroba. Namun, koloni belum terbentuk
secara sempurna. Hal ini disebabkan waktu inkubasi kurang lama atau suhu yang
dibutuhkan mikroba untuk membentuk koloni kurag optimum atau dapat dikatakan
suhu berpengaruh pada pembentukan koloni. Hal ini sesuai pendapat llyas dalam
Khairani (2010) bahwa bentuk dan jumlah pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh
lingkungan yang tidak mengutungkan, faktor makanan dan suhu.
4.3 Penghitungan Jumlah Mikroba
Berdasarkan
praktikum yang telah dilakukan diperoleh hasil sebgai berikut :
Tabel 1. Hasil Perhitungan
Koloni Bakteri
|
Medium
|
Pengenceran
|
SPC
|
||
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
||
|
PDA
|
130
|
50
|
37
|
1,3 x 10-4
|
Sumber : Data Primer Praktikum
Mikrobiologi, 2014
Pada hasil
percobaan yang dilakukan pengenceran sebanyak 3 kali, terlihat pada cawan
pertumbuhan dari koloni tidak terlalu rapat. Sebanyak 130 koloni
bakteri terlihat pada pengenceran 10-3 ,
sedangkan pada pengenceran 10-4 terlihat
50 koloni
bakteri, dan sebanyak 37
koloni bakteri terlihat pada pengenceran 10-5. Hal ini kemudian diperkuat dengan pendapat
Harmita dan Maksum (2008) yang menyatakan bahwa pertumbuhan bakteri yang terlalu rapat,
hasilnya akan sulit dipertanggungjawabkan. Demikian juga untuk pertumbuhan yang
terlalu jarang sehingga diperlukan pemilihan cawan petri yang pertumbuhan
koloni bakterinya paling layak untuk
dihitung, yang biasanya diambil dari cawan petri yang pertumbuhan koloninya
berkisar 30-300 koloni per cawan petri. Dalam hal ini Chang (2003)
menambahkan bahwa dalam melakukan proses pengenceran, penambahan lebih banyak
pelarut ke dalam sejumlah tertentu larutan stok akan mengubah (mengurangi)
konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat pelarut yang terdapat dalam
larutan, dengan kata lain mol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan mol
zat terlarut setelah pengenceran.
4.4. Pewarnaan Gram
4.4.1 Lactobacillus
acidophilus
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Lactobacillus acidophilus
diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Lactobacillus
acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
Lactobacillus acidophilus
|
|
|
|
|
Bentuk : Bacil
Warna : Biru keunguan
Gram : B
(Positif)
|
Bentuk : Bacil
Warna : ungu
Gram : B (Positif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Berdasarkan
hasil pengamatan pada percobaan pewarnaan gram terhadap bakteri Lactobacillus didapatkan warna ungu
dan berbentuk bacillus. Hal ini
sesuai dengan pendapat Dwijoseputro (2004), yang menyatakan bahwa
bakteri berdasarkan morfoginya bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga
golongan yaitu basil, kokus dan spiril. Basil (bacillus) dan bakteri lactobacillus
ini berbentuk batang, bervariasi
panjang dan ramping. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi gram positif dan
negatif, hal sesuai dengan pendapat Agustina et al., (2013) yang
menyatakan bahwa pewarnaan grampositif adalah yang mempunyai zat warna asli
yaitu ungu jika di tetesi, dan gram positif lebih peka terhadap fenol,
penisilin, dan resisten terhadap streptomisinin. Dan gram negatif berwarna
merah karena yang demikian ini dinamai gram variabel.
4.4.2 Escherichia
coli
Berdasarkan
hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap Escherichia
coli diperoleh hasil sebagai berikut :
Ilustrasi 1. Penampang bakteri Escherichia
coli
|
Escherichia coli
|
Escherichia coli
|
|
|
|
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A
(negatif)
|
Bentuk : Coccus
Warna : Merah
Gram : A (negatif)
|
Sumber : Data
Primer Praktikum Sumber
: www.biologicons.com
Mikrobiologi, 2014
Pada percobaan pewarnaan gram pada
bakteri Escherichia coli dengan menggunakan pewarna
gram berupa violet krista, lugol, etanol serta safranin, didapatkan hasilnya adalah warna
merah. Hal ini menunjukkan bahwa sifat dari bakteri ini adalah gram negatif.
Pada saat mengamati menggunakan mikroskop, menunjukkan adanya sifat dari bakteri Esterechia coli yang menyendiri dan
sebagian berkelompok membentuk koloni. Bentuk yang nampak yaitu bulat-bulat
kecil dan merata. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Sousa (2006) yang
menyatakan bahwa Escherichia coli merupakan
bakteri non-spora berbentuk bulat. Hal
yang sama dijelaskan oleh
Melliawati (2009) bahwa secara umum E. coli bentuk bulat cenderung ke batang panjang. Pada bentuk
batang, biasanya berukuran 0,5 x 1 - 3 ยต. terdapat yang sendiri-sendiri, berpasang-pasangan dan
rangkaian pendek, biasanya tidak membentuk spora, merupakan bakteri gram
negatif, merupakan parasit dalam saluran pencernaan makanan manusia dan hewan
berdarah panas, serta koloninya ditemukan dalam feses.
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1
Simpulan
Hasil praktikum
mikrobiologi dapat disimpulkan, bahwa metode sterilisasi terdiri dari dua
jenis, dapat dilakukan dengan sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Bakteri dapat dikembangbiakkan melalui medium agar, PDA serta dapat
diketahui ciri-cirinya melalui pewarnaan gram dan melihat melalui mikroskop. Bakteri
dapat dihitung jumlah koloninya, dengan bantuan loop dan counter. Jenis
bakteri, dapat diidentifikasi menggunakan pewarna gram, sehingga diperoleh
hasil gram positif dan gram negatif. Lactobacillus acidophilus merupakan
bakteri gram positif, sedangkan Escherichia
coli merupakan bakteri gram negatif.
5.2
Saran
Diharapkan
pada praktikan lebih memperhatikan ketersediaan alat serta bahan yang akan
digunakan dalam praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan baik, serta
diharapkan melakukan pengecekan terhadap alat-alat yang akan digunakan sehingga
tidak terjadi kerusakan yang dapat berakibat fatal. Dan tidak lupa meningkatkan
komunikasi antara praktikan dan asisten.
daftar pustaka?
BalasHapus